实时荧光定量PCR怎么使用

2023-03-11 10:42:54

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实时荧光定量PCR是一种用于定量PCR反应的技术，其核心是使用荧光探针来监测反应过程中产生的荧光信号。该技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等方面具有广泛的应用。

实时荧光定量PCR仪

实时荧光定量PCR技术主要包括以下几个方面：

1. 可靠的荧光探针设计：荧光探针选择的好坏直接影响实验的结果。荧光探针必须与目标序列特异性结合，不能与模板之外的序列结合，否则测定的PCR产物浓度将被高估。

2. 稳定、高灵敏荧光检测系统：实时PCR实验依靠精确的荧光检测系统，荧光的强度取决于荧光染料的濃度及PCR產物量的多寡。呈线性增加，欲得到准确的PCR產物量就必须确保荧光染料不能受到化学或物理因素的影响降解或失去荧光性能。

3. 构建标准曲线：构建标准曲线即以所测荧光值为纵坐标，PCR产物的浓度为横坐标，作出一条从北京>直线，即PCR标准曲线。该曲线可用于计算未知样本中PCR产物的浓度。

4. 优化反应条件：PCR反应条件的优化对PCR产物的生成、荧光信号的强度及标准曲线的斜率等都有影响。因此，在PCR反应过程中，应该认真观察实验结果，并根据实验反应的情况调整PCR反应条件。

实时荧光定量PCR的操作步骤

1. 实验前准备：包括荧光探针的设计、荧光强度检测系统的选择等。

2. 样本制备：根据实验需要，从样品中提取DNA、RNA等所需的分子，纯化后进行定量。

3. 反应体系准备：依据实验所需，在反应管组装PCR反应体系，包括不同的PCR缓冲液、MgCl2、引物、荧光探针、稳定酶、被测样品等。

4. 实时PCR反应：通过PCR仪器进行实时PCR反应，具体反应条件可根据不同的引物和荧光探针进行调整。

5. 数据分析：通过实时PCR仪器测量PCR反应的荧光强度，并通过荧光信号的大小计算PCR产物浓度，并绘制标准曲线等。