实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在PCR反应中加入荧光基团,在每个循环反应结束时检测反应体系的荧光信号值,通过标准品绘制标准曲线对反应体系中的特定核酸序列进行定量的方法。
QPCR的检测流程
· QPCR的检测流程主要包括Ct值检测,绘制标准曲线和熔解曲线分析三方面:
· 1. Ct值检测
在PCR反应过程中,每经过一个循环PCR产物量增加,同时荧光染料会特异性地掺入DNA双链中,相应的荧光信号强度也跟着增加。在每个循环反应结束后进行荧光信号检测,就可以得到一条以循环数为横坐标和荧光强度为纵坐标的“S”形荧光扩增曲线。
QPCR的主要应用
·1. 绝 对定量
主要用于二代测序文库定量,相较于其他浓度检测方法更为准确不会受样本中未加上接头核酸的干扰。
·2. 核酸检测
可以快速地对样本中较低含量的病毒核酸进行相对定量,判定阴性或阳性。常用于新冠检测等。
·3. 多重定量
与多重PCR相结合,通过设计不同探针携带不同荧光基团可以实现同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物,或对多个目的基因进行定量。
·4. 基因拷贝数变异检测
使用单拷贝基因数样本作为标准品,可以实现低基因拷贝数精 确检测。
·5. circRNA验证
通过设计接头,可以使circRNA与线性RNA分开进行定量,并通过溶解曲线进行验证。