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LightSpeed系列  DNA Assembly Mix Plus(快速多片段DNA组装预混液)

LightSpeed系列 DNA Assembly Mix Plus(快速多片段DNA组装预混液)

  • 所属分类:修饰酶
  • 浏览次数:
  • 发布时间:2022-05-09 09:22:52
产品参数

产品介绍

  产品组成

  

货号组分规格
EZ22046S-ALightSpeed DNA Assembly Mix250μl
EZ22046S-BpUC19 Control Plasmid, Linearized (Ampr, 40 ng/μl)5μl
EZ22046S-C500 bp Control Fragment (20 ng/μl)5μl


  产品简介

  基于重组原理的无缝克隆技术,作为新一代的克隆方法,不依赖繁琐的酶切、连接步骤,也不需要末端补平等操作,依据 DNA 片段与线性化载体末端的 15~25 nt 同源序列的重组,可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点,载体自连背景极低,是一种简单、快速、 高效的 DNA 定向克隆技术。 LightNing™ DNA Assembly Mix 无缝克隆试剂盒最快仅需 5 分钟即可完成单片段重组,且阳性率高于 95%。Mix 中添加的辅助因子, 有效提高克隆阳性率;经优化的反应体系,能够一定程度上耐受未纯 化 PCR 产物中含有的杂质。升级版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。

  实验步骤

  1. 实验流程概要

  设计与相邻片段末端具有重叠序列的扩增引物;准备载体;酶切或反向PCR扩增;50℃反应5~15min;转化感受态

  2.线性化克隆载体制备

  选择合适的克隆位点,对载体进行线性化,载体的线性化可以通过酶切或反向 PCR 扩增完成。

  ① 酶切制备 推荐使用 LightNing™ 快速内切酶进行双酶切,使载体线性化完 全,以降低转化背景 ( 假阳性克隆 );若使用单酶切进行线性化,可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。 注 1:经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化,经单酶切则需要去磷酸化; 注 2:酶切完成后,应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应。

  ② 反向 PCR 扩增制备 为减少扩增突变的引入,推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增。推 荐使用预线性化质粒作为模板,以减少环状质粒模板残留对克隆阳性 率的影响。

  3. 插入片段 PCR 引物设计 PCR 引物的 5' 端必须包含与其相邻片段(插入片段或载体)末端 同源的 15~25 nt(推荐 18 nt)序列。假如载体为粘性末端,且 3' 端 突出,则引物设计必须包含突出部分;若 5' 端突出,则引物设计可以 包含突出部分,也可以不包含。 插入片段正向扩增引物: 5'—上游载体末端同源序列 + 酶切位点(可选)+ 基因特异性正向 扩增序列— 3' 插入片段反向扩增引物: 3'—基因特异性反向扩增序列 + 酶切位点(可选)+ 下游载体末端 同源序列—5' 注 1:尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆,当载体克隆位点上下游 25 nt 区域内 GC 含量为 40%~60% 时,重组效率最高;

  


  注 2:本试剂盒所提供的 pUC 19 载体(Ampr )连接端序列如下:

  


  4. 插入片段的 PCR 扩增 推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增,以减少扩增突变的引入。建 议使用纯化后的 PCR 产物进行无缝克隆反应,若 PCR 产物经琼脂糖 凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物,可直接使用,但加样体积不应超过 总反应体积的 20%。

  5. 重组反应

  ① 于冰水浴中配置以下反应体系:

  


  a. 最适载体用量 (ng) = 0.02 × 载体碱基对数,即 0.03 pmol。 b. 插入单片段,最适片段用量(ng)= 0.04 × 片段碱基对数。

  注 1:若插入单片段的长度大于载体,则应互换载体与插入片段用量;

  注 2:若插入片段的长度小于 200 bp,则插入片段应使用 5 倍载体用量;

  注 3:若按上述公式计算得到的用量超过最低 / 最高值,则建议直接按最低 / 最高用 量使用;

  注 4:载体片段过长、插入片段过长克隆阳性率均会降低。 重组反应体系配制完成后,用移液枪轻轻吸打混匀各组分,避免 产生气泡,切勿涡旋。

  ② 将反应体系置于 50℃,反应 5~15 min。 注 1:推荐使用 PCR 仪等温控比较精准的仪器进行反应,反应时间不足或太 长克 隆效率均会降低; 注 2:当载体骨架在 10 kb 以上或插入片段在 4 kb 以上时,建议延长反应时间到 15~30 min; 注 3:50℃反应完成后,建议进行瞬时离心,将反应液收集至管底。

  ③ 将反应液离心管置于冰上冷却,之后进行转化或者储存于 -20℃。 注 1: -20℃储存的重组产物,建议在 1 周内使用。

  6. 重组产物转化 取 5~10 μl 反应液,加入到 100 μl 感受态细胞中,缓慢吸打混 匀,冰上放置 30 min。42℃ 热激 45~60 sec,冰浴 5 min。加 500 μl SOC 或 LB 培养基,37℃ 振荡培养 40~60 min(200 rpm)。将 菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上,倒置于 37℃ 过夜培养。

  注 1:不同感受态细胞最后的克隆阳性率会有所差别,推荐使用转化效率 > 108 CFU/ μg 的感受态细胞;

  注 2:菌落数取决于 PCR 产物与线性化载体的数量和纯度;

  注 3:阳性对照平板通常生长大量白色单菌落,阴性对照平板只生长很少的菌落。

  7. 阳性克隆检测:挑取单菌落至 10 μl ddH2O 中混匀,95℃裂解 10 min 后,取 1 μl 裂解液作为模板,进行菌落 PCR 鉴定,或将单菌落接种至抗性培养 基中培养过夜后,提取质粒进行酶切鉴定。

  注 1:菌落 PCR 时建议至少使用一条通用引物,避免假阳性结果;

  注 2:必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。

  常见问题

  

  储存温度:   -20°C储存

  品       牌:   三狮生物


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