实时荧光定量PCR仪使用时注意事项

2023-07-06 10:05:13

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实时荧光定量PCR仪是一种通过荧光信号实时检测PCR产物的增加量，从而定量分析起始模板DNA序列的数量的技术。在使用实时荧光定量PCR仪时，注意以下事项可以保证实验的准确性和可靠性。

实时荧光定量PCR仪

样品制备：准确的样品制备是实时荧光定量PCR实验的关键。必须严格控制反应体系中的起始模板DNA的数量和质量。样品的质量受到很多因素的影响，如DNA的纯度、完整性、起始浓度和存在的抑制物等。确保使用高质量的DNA提取方法，并对提取的DNA进行适当的纯化和稀释。

防止污染：实时荧光定量PCR实验中，样品的污染是十分常见的问题，会导致产生误差和假阳性结果。因此，在实验前要做好充足的准备工作，减少污染的可能性。实验操作过程中要使用无DNase、RNase的试剂和器具，并进行良好的实验室操作，如佩戴手套、使用滤嘴和离心管等。

引物和探针的设计：PCR引物和探针的设计是实时荧光定量PCR实验的重要步骤。合理设计的引物和探针可以提高PCR的特异性和灵敏性，减少非特异性扩增和背景信号。确保引物和探针的质量，避免引物和探针的二聚体形成，保证引物和探针的完整性。

反应体系的配制：反应体系的配制影响PCR的灵敏度和特异性。应根据实验需要和目的，选择合适的PCR反应体系。反应体系中的各组分需要严格按照比例添加，保证每个反应的组分完全均一混合，从而保证实验结果的复制性和可信度。

温度控制和循环程序：实时荧光定量PCR仪需要严格的温度控制和合适的循环程序，以保证PCR扩增的效率和产物的特异性。在进行实验前根据实验方案设置好PCR循环程序，并核对仪器是否准确。在实验过程中要监测温度的准确性和一致性，确保实验结果的稳定性。

阈值和标准曲线的设定：实时荧光定量PCR分析的关键是准确确定阈值判断相关荧光信号的阈值线和标准曲线。阈值设置的不准确会影响结果解读和定量结果的可靠性。标准曲线的选择合适的模板浓度和数量是设定准确的定量曲线的前提。

负对照和阳性对照的设置：实时荧光定量PCR实验中，设置负对照和阳性对照是验证实验结果的重要措施。负对照用于检测实验过程中是否存在污染或假阳性结果的产生，阳性对照用于验证实验的可靠性和灵敏度。