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实时荧光定量PCR技术的简介

2022-12-14 15:58:39

  实时荧光定量PCR技术的简介

自从PCR技术问世以来,随着技术的推广和应用,派生了许多适用于不同目的的改良方法和技术,如模板为RNA的逆转录PCR(Reverse Transcriptase PCR,RT-PCR);能同时检测不同目的基因的多重PCR(multiplex PCR);能提高扩增反应的敏感性和特异性的巢式PCR(nested PCR);通过检测荧光素、或同位素、或酶活性来显示目的片段存在的标记引物PCR(Labeled Primers PCR);将抗原抗体的特异性反应与PCR技术结合起来,以检测微量蛋白质的免疫PCR(IM-PCR)以及能对待测模板定量的实时荧光定量PCR等等。

实时荧光定量PCR仪

实时荧光定量PCR是指在PCR体系中加入荧光基团,使PCR产物和荧光相关,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且整个PCR过程可实现自动化,且耗时短,操作方便,不易污染。

一、定量原理

实时荧光定量PCR是利用荧光信号的变化,实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

1.扩增曲线

在实时荧光定量PCR进程中,通过荧光定量PCR仪,在PCR每个循环进行一次荧光信号的收集,以荧光强度为纵轴,循环次数为横轴,所得到的曲线称为PCR的扩增曲线。

2.荧光阈值

实时荧光定量PCR的前面十多个循环,荧光强度变化不大,荧光强度的平均值可称为基线值,在基线值的基础上,增加一定数量后得到一荧光值,这一点后,随着循环次数的增加,荧光强度明显增强,因此称该值为荧光阈值。一般取PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。

3.Ct值与标准曲线

Ct值是指PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。实验发现,Ct值与反应管内的模板数密切相关,起始拷贝数越多,Ct值越小。

二、分类与工作原理

根据引入荧光标记的类型,常用的实时荧光定量PCR有以下几种:SYBR Green法、水解探针法(TaqMan法)、分子信标法等。


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