实时荧光定量PCR (qPCR)实验操作流程
实验原理:
实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)指的是在PCR进行的同时,对其过程进行监测的能力(即实时)。
因此,数据可在PCR扩增过程中,而非PCR结束之后,进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中,反应以循环中首 次检测到目标扩增的时间点为特征,而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高,则会越快观察到荧光的显著增加。相反,终点法检测(也称“读板检测”)测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。
实验准备:
cDNA模板、引物、qPCR mix、ddH2O等。
实验步骤:
1.配样
按照实验需要对cDNA模板加水作适当稀释,涡旋混匀后离心,根据实际所检测样品和基因的数量计算加样体系,按照体系以此加入ddH2O,qPCR mix,引物,配成一管mix,涡旋混匀,后离心。准备适量的qPCR八连排板或者96孔板,在这里我们用的是八连排管,置于冰上操作,将上步混匀的mix按每孔19μL加入到八连排孔中。
2.加模板
在每个孔各加入1μL的cDNA模板。加样完毕后,盖上八连排管盖,注意尽量从孔边上压紧管盖。涡旋混匀后离心,去除气泡。
3.上机反应
上机前先设置程序,具体如下:设置反应温度,设置孔板信息,样品放入仪器中,开始反应。
4.导出数据
反应结束后得到qPCR数据,根据溶解曲线,查看数据的有效性,导出数据为EXCEL文件并保存。
5.实验结束
实验完毕,打开qPCR仪,取出八连排管,盖上qPCR仪,关闭电脑,仪器。
注意事项:
1.由于分装过程中,吸头具有表面张力,会导致样品损耗,因此根据实际需要,多配一些。
2.实验中用移液枪时注意保持相同的力度。匀速吸打。
3.操作应于冰上进行,防止因操作时间过长,影响酶活性。