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实时荧光定量PCR技术的基本原理

2022-07-27 16:10:12

 实时荧光定量PCR技术的基本原理

在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团,这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出,利用荧光信号积累,实时监测整个PCR进程,在PCR循环中,测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值(Threshold cycle)概念,Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的小循环数,是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。

实时荧光定量PCR仪

荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号,可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线,然后计算相对方程式。

方程式的斜度可以用来检查PCR的效率,所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R²>0.99),这样才能认为实验的过程和数据是可信的,使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR仪都有软件,可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。

其特点有:

(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量,进行实时动态连续的荧光监测,避免终点定量的不准确性,并且消除了标本和产物的污染,且无复杂的产物后续处理过程。

(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA,或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得,打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。


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