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荧光定量PCR常见问题

2022-01-06 13:50:32

1.荧光定量PCR实验中无Ct值出现

(1)序列或者引物有误:检测样品中不含有待检测基因,在NCBI数据库仔细查找待检测基因序列,重新重新设计引物。

(2)核酸模板降解:避免核酸样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况,在操作过程中使用的离心管、吸头等耗材均为一次性。

(3)核酸模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的高浓度做起,但要注意高浓度核酸会导致非特异性扩增及气溶胶污染。

(4)反应的循环数不够:荧光定量PCR反应循环数一般在35个循环以上,但是过多的循环次数可增加背景值(建议不超过45个循环)。

(5)引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性,若是电泳条带呈弥散状,可考虑重新合成引物或探针,建议使用前进行分装。

(6)检测荧光信号的步骤有误:荧光定量PCR一般在退火结束或延伸结束时进行信号采集,如采集步骤有误会导致结果无法准确判读。


2.荧光定量PCR实验中Ct值出现过晚

原因分析与解决方案:

(1)扩增产物太长:一般采用80-150bp的产物长度,长于200bp的片段建议采用三步法扩增。

(2)检测基因结构复杂:检测基因包含高GC、复杂二级结构和长片段等复杂结构,都会影响PCR扩增。

(3)扩增效率低:优化反应条件,重新设计引物或探针,荧光染料存在降解,体系中存在抑  制物,改用三步法进行反应等。

(4)模版降解或模版浓度太高:通过PAGE电泳检测其完整性,若模板存在降解则重新提取核酸模板,若浓度太高则进行稀释。

(5)试剂灵敏度不好:试剂(尤其是预混液)检测性能不好,灵敏度低、抗干扰能力差,建议更换更高灵敏度、更强抗干扰的试剂。

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